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食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管癌的主要亚型，新辅助免疫检查点阻断（ICB）治疗已展现出一定疗效，但临床中患者应答差异显著，始终缺乏可靠的疗效预测标志物——这一问题一直困扰着临床医生和研究者。

2023年11月13日，《Cancer Cell》杂志发表了由上海交通大学医学院附属上海胸科医院李志刚教授、温州医科大学苏建忠教授、中国医学科学院刘芝华教授及中国科学院上海营养与健康研究所龙凌云教授团队的合作研究，该研究发现了一群特定的类祖细胞耗竭型CD8+ T细胞（CD8+ Tex-SPRY1）是决定ESCC新辅助免疫治疗响应的关键因素。

今天我们就来拆解一下这篇文章：Progenitor-like exhausted SPRY1+CD8+ T cells potentiate responsiveness to neoadjuvant PD-1 blockade in esophageal squamous cell carcinoma

研究概述

ESCC新辅助ICB治疗的临床获益有限且缺乏有效生物标志物，研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）等技术，分析接受该治疗的ESCC患者肿瘤样本，鉴定出CD8+ Tex-SPRY1细胞亚群。这类细胞具有祖细胞样耗竭T细胞（Tpex）表型，可特异性预测ICB治疗应答和患者生存，其通过与促炎巨噬细胞、三级淋巴结构（TLS）相关B细胞相互作用，增强抗肿瘤免疫。

实验设计

纳入接受新辅助PD-1抑制剂联合化疗的可手术ESCC患者，收集治疗前（内镜活检）和治疗后（手术切除）的肿瘤样本，部分患者同时收集外周血样本；通过scRNA-seq、单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）构建细胞图谱；结合多重免疫组化、bulk RNA-seq进行临床队列验证；利用小鼠过继性细胞转移实验、流式细胞术等验证CD8+ Tex-SPRY1细胞的功能；通过生物信息学分析探索细胞亚群间的相互作用机制。

研究结果

• •图1：单细胞测序展示了ESCC新辅助治疗前后的免疫微环境动态，发现CR患者在治疗后经历了显著的微环境重塑。

• •图2：鉴定出CD8+ Tex-SPRY1细胞亚群具有类祖细胞特征，且其比例与肿瘤代谢活性降低（PET-CT评价）显著相关。

• •图3：在独立验证队列中，CD8+ Tex-SPRY1特征评分在预测免疫治疗响应方面表现优于PD-L1，且是患者生存的独立预测因子。

• •图4：动物实验证实Spry1表达能提升肿瘤浸润T细胞中Tpex的比例，并显著增强抗PD-1治疗的抑瘤效果。

• •图5：促炎型Macro-MMP9巨噬细胞通过CXCL9/10-CXCR3轴与CD8+ Tex-SPRY1细胞形成正反馈环路，共同维持免疫活性。

• •图6：三级淋巴结构（TLS）相关的B细胞通过IL23信号促进CD8+ Tex-SPRY1细胞活化，并诱导Tfh细胞参与抗肿瘤响应。

生信分析

Cell Ranger

将scRNA-seq和scTCR-seq测序数据比对到人类参考基因组（GRCh38），生成原始表达矩阵和TCR序列数据。

Seurat

进行单细胞数据标准化、批次校正、聚类分析和细胞亚群注释，构建SCT标准化矩阵并筛选差异表达基因。

Scanpy

对单细胞数据进行预处理、PCA降维、UMAP可视化和 Leiden 聚类，辅助细胞亚群细分和轨迹分析。

Scrublet

估算每个样本中的潜在双细胞比例，设定预期双细胞率为5%，过滤低质量数据。

BBKNN

校正不同样本间的批次效应，构建批次平衡的k近邻（KNN）图，为后续聚类做准备。

Leiden algorithm

对单细胞数据进行聚类分组，通过调整分辨率参数（0.3-0.9）获得不同精细度的聚类结果。

inferCNV

通过比较上皮细胞与参照正常细胞的基因表达强度，推断细胞拷贝数变异，用于区分恶性与非恶性上皮细胞。

scVelo & Dynamo

基于RNA速率分析，推断CD8+ T细胞的分化发育轨迹及状态转换动态。

Slingshot

在无监督模式下推算CD8+ T细胞亚群的发育谱系及伪时间数值。

CellChat & NicheNet

分析细胞间的配体-受体相互作用，预测配体对目标细胞下游基因表达的调控潜力。

GSVA & ssGSEA

用于在Bulk RNA-seq验证队列中计算特定细胞亚群的特征基因集评分。

velocyto

生成loom文件，为RNA速度分析提供基础数据支持，辅助细胞轨迹推断。

scirpy

处理scTCR-seq数据，分析T细胞克隆型组成和谱系追踪，鉴定共享克隆型。

DESeq2

用于bulk RNA-seq和单细胞差异表达基因分析，计算基因表达倍数变化和校正后P值。

HTSeq-count

统计bulk RNA-seq数据中每个基因的读段计数，为差异表达分析提供输入数据。

HISAT2

将bulk RNA-seq清洁读段比对到人类参考基因组，进行转录组定位。

fastp

预处理bulk RNA-seq原始数据，过滤低质量读段，获得清洁数据用于后续分析。

Mutect2

从全外显子测序（WES）数据中调用体细胞变异，结合正常对照样本筛选高可信度突变位点。

ANNOVAR

对WES检测到的体细胞变异进行功能注释，关联ESCC已知驱动基因和癌症相关通路。

Vision

计算单细胞数据中基因特征的表达分数，辅助细胞亚群功能注释和表型验证。

总结

研究意义

本研究界定了食管鳞癌中一群具有类祖细胞特征的耗竭型CD8+ T细胞（CD8+ Tex-SPRY1），并证明其可作为预测免疫治疗响应的特异性生物标志物,。此外，揭示了以CD8+ Tex-SPRY1细胞为核心，与巨噬细胞及B细胞协同作用的免疫激活网络，为食管鳞癌个体化免疫治疗和联合用药方案的设计提供了理论基础。

文章复现

这篇文章的原始数据和生信分析代码都公开了，非常全面。

原始数据：

• 单细胞测序及全外显子测序数据：HRA003312

(https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/browse/HRA003312)

• Bulk RNA-seq验证数据：HRA005507

(https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/browse/HRA005507)

代码仓库：

• https://github.com/zgyaru/anti-PD1_ESCC

• https://doi.org/10.5281/zenodo.8340388

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